загрузка...
Биохимия вина  |  Превращение аминокислот дрожжами
Биохимия вина

Биосинтез органических кислот

Основные представления о путях превращений органических кислот в растениях и микроорганизмах изложены в работах С. П. Костычева, В. С. Бутуевича, М. В. Федорова, Т. Кшонца, К. Бергауэра, X. Кребса и В. Джонсона, X. Корберга и X. Креб-са, Д. Девиса и др.

С. П. Костычев на заре развития биохимии считал, что образование лимонной кислоты немыслимо без синтетических реакций. Впоследствии это было подтверждено советскими и зарубежными исследователями.

Позднее было доказано, что синтез лимонной кислоты протекает по циклу Кребса посредством конденсации щавелевоуксус-ной кислоты с ацетил-КоА. Был выделен фермент, который катализировал конденсацию щавелевоуксусной кислоты с ацетил-КоА, поэтому этот фермент был назван конденсирующим энзимом.

Образование лимонной кислоты из глюкозы — сложный биохимический процесс. Вначале из глюкозы образуется пировино-градная кислота, но этот процесс чрезвычайно сложен.

Изучение анаэробного распада углеводов привело к установлению следующих промежуточных продуктов: углеводы + фосфорная кислота -> гексозофосфат -> триозофосфат + фосфо-глицериновая кислота -> фосфопировиноградная кислота. Дальнейшее превращение пировиноградной кислоты в зависимости от наличия ферментативных систем у дрожжей протекает различно.

Известно, что пировиноградная кислота является исходным продуктом для синтеза целого ряда важнейших веществ, определяющих направление обмена в живой клетке.

Дрожжи способны декарбоксилировать пировиноградную кислоту в уксусный альдегид, они также способны непосредственно превращать пировиноградную кислоту в уксусную посредством окислительного декарбоксилирования.

При спиртовом брожении пировиноградная кислота через уксусный альдегид образует этанол, а при гликолизе под действием лактикодегидрогеназы и НАД-Н2 она превращается в молочную. Пировиноградная кислота участвует в реакциях переамини-рования, она легко аминируется в аланин.

Пировиноградная кислота участвует в синтезе кислот по циклу Кребса. Но прежде, чем она будет вовлечена в циклы ди- и трикарбоксильных кислот, она должна, с одной стороны, карбок-силироваться в щавелевоуксусную кислоту, а с другой — в присутствии коэнзима А превратиться в ацетил-КоА. Эти две реакции можно представить в следующем виде:

СН3—СО—СООН+С02+АТФ->НООС—СН2—СО—СООН+АДФ +Ф ,

СН3—СО—COOH+HS~KoA+НАД->СН3—СО~КоА+НАД.Н2+С02.

Коэнзим А является переносчиком ацетильной группы, которая присоединяется к нему через эфирную микроэргическую связь. Поэтому в микроорганизмах широко распространены аце-тилфосфаты, которые принимают участие в биохимических реакциях, связанных с выделением энергии. Роль коэнзима А в биологических окислениях и синтезах стала более интенсивно исследоваться после препаративного приготовления его, осуществленного Ф. Линеном и Е. Рейхертом. Была установлена взаимная связь между изменением содержания коэнзима А в дрожжевых клетках и скоростью окисления уксусной кислоты. Доказано, что при недостатке коэнзима А дрожжи слабо окисляют уксусную кислоту.

Ацетил-КоА образуется не только из пировиноградной кислоты, но и из уксусной кислоты и уксусного альдегида. Источником образования щавелевоуксусной кислоты являются яблочная и аспарагиновая кислоты, а также путь карбоксилирования пировиноградной кислоты.

Дрожжи обладают всеми ферментативными системами для образования щавелевоуксусной кислоты из указанных соединений, они содержат также коэнзим А и способны образовывать ацетил-КоА из пировиноградной и уксусной кислот.

С помощью изотопного углерода в виде NaHC1403 нам в 1959 г. удалось доказать, что винные дрожжи способны карбок-силировать пировиноградную кислоту с образованием щавелевоуксусной кислоты. Последняя реагирует с ацетил-КоА и образует лимонную кислоту по схеме

Методом бумажной хроматографии из культуральной жидкости дрожжей были выделены радиоактивная лимонная кислота, молочная, яблочная и янтарная.

Винные дрожжи способны превращать лимонную кислоту по циклу трикарбоксильных кислот и образовывать янтарную и гли-оксалевую кислоты, последняя конденсируется с ацетил-КоА и образует яблочную кислоту по глиоксалатному циклу.

Кроме- того, винные дрожжи также способны синтезировать лимонную кислоту из глютаминовой кислоты и аланина путем дезаминирования их в соответствующие кетокислоты и в дальнейшем превращать их по циклу Кребса.

Во-первых, винные дрожжи способны карбоксилировать пиро- виноградную кислоту в щавелевоуксусную. Они также способны превращать пировиноградную кислоту в ацетил-КоА. Последний конденсируется с щавелевоуксусной кислотой и образует лимонную кислоту.

Во-вторых, дрожжи путем окислительного декарбоксилирования превращают пировиноградную кислоту в уксусную. Последнюю они способны конденсировать в янтарную кислоту через ацетил-КоА, янтарную кислоту они превращают в щавелевоуксусную через фумаровую и яблочную. Щавелевоуксусная кислота конденсируется с ацетил-КоА и образуется лимонная кислота.

загрузка...

В работе С. В. Дурмишидзе (1965) было показано, что меченая уксусная кислота превращается в янтарную, фумаровую и гликолевую кислоты. По данным автора процесс ассимиляции и превращения уксусной кислоты протекает на всех стадиях алкогольного брожения. Известно также, что уксусная кислота в виде

ацетил-КоА через цикл ди- и чрикарооновых кислот окисляется до С02 и воды.

Генезис уксусной кислоты при алкогольном брожении долгое время оставался неясным и только благодаря работам С. П. Ко-стычева стало известно, что дрожжи превращают уксусный альдегид и в этанол и уксусную кислоту по следующей схеме:

По современным представлениям эта реакция протекает в два этапа: на первом уксусный альдегид присоединяет кислород воды и окисляется до уксусной кислоты, при этом водород воды восстанавливает НАД, который участвует в этой реакции: СН3СНО+Н20+НАД->СНзСООН+НАД • Н2.

Образовавшийся НАД•Н2 восстанавливает вторую молекулу уксусного альдегида в спирт: СН3СНО+НАД•Н2->СНз—СН2ОН.

Исследования Е. Пейно показали, что в начале брожения количество летучих кислот, в частности уксусной, заметно возрастает, затем процесс замедляется, количество летучих кислот стабилизируется и в конце брожения начинает убывать. Этот автор считает, что в период интенсивного размножения дрожжей их восстановительная способность высока, поэтому и происходит восстановление уксусной кислоты в этанол.

Известно, что при усилении восстановительных процессов происходит максимальное накопление этанола. Однако трудно понять непосредственное восстановление уксусной кислоты в этиловый спирт, как это понимает Е. Пейно.

Е. Пейно использовал способность дрожжей восстанавливать уксусную кислоту в этанол в анаэробных условиях для исправления вин с высоким содержанием уксусной кислоты, как это было сделано Н. Ф. Саенко для лечения больных вин хересными дрожжами.

Образование уксусной кислоты в процессе спиртового брожения сусла зависит от рН среды и от температуры брожения. При брожении в менее кислой среде (рН 6) вначале образуется значительное количество уксусной кислоты, затем скорость образования уменьшается. При рН 7,5 она образуется равномерно в течение всего периода, а при рН 2,5 она в вине не накапливается.

Е. Пейно исследовал 32 расы дрожжей на способность образовывать летучие кислоты в присутствии кислорода и без него. Среднее количество образующихся при брожении в аэробных условиях летучих кислот составляло 0,52 г/л, а в анаэробных условиях — 0,69 г/л.

Г. Г. Валуйко также наблюдал, что в присутствии кислорода летучих кислот образуется меньше. Известно, что аэробиоз подавляет образование летучих кислот. Объясняется это тем, что при сбраживании сусла в аэробных условиях уксусная кислота окисляется в ацетил-КоА через цикл Кребса.

В основном уксусная кислота образуется не только в процессе брожения, но и при ферментативном окислении спирта. Это происходит при выдержке виноматериалов с дрожжевым осадком. Процесс усиливается при аэробных условиях, т. е. если бочки не доливать вином до шпунта.

В результате разрыва цепочки жирной кислоты между а- и р-углеродными атомами образуется уксусная кислота; новая высокомолекулярная кислота будет содержать на 2 атома углерода меньше, чем исходная жирная кислота.

Известно, что при более высоком рН среды образуется меньше 2,3-бутиленгликоля и ацетоина и значительно больше — глицерина, летучих кислот и янтарной кислоты. Процесс образования янтарной кислоты очень сложный. Превращения уксусной кислоты начинаются с образованием ацетил-КоА, Конденсируются не две молекулы уксусной кислоты, а активные ацетильные группы в виде ацетил-КоА, которые и образуют янтарную кислоту.

2СН3—CO-S—КоА+АДФ+Ф+НАД+Н20-> ->СООН—СН2—СН2—СООН+2Н5~КоА+АТФ+НАД•Н2.

Как показали исследования В. 3. Гваладзе, при брожении сусла в анаэробных условиях количество янтарной кислоты бывает незначительно, а в аэробных условиях увеличивается.

Янтарная кислота образуется также при расщеплении изоли-монной кислоты при действии изоцитратазы по схеме:

Глиоксалевая кислота, согласно глиоксалатному циклу, вступает в реакцию с ацетил-КоА и образует яблочную кислоту по схеме

Эти три кислоты были найдены в винограде и вине.

В вине была обнаружена а-метиляблочная кислота, или ли-монно-яблочная. Она образуется в результате конденсации пиро-виноградной кислоты с ацетил-КоА (Ж. Карл, 1969):

Существует и другой путь образования а-метиляблочной кислоты — это конденсация глиоксалевой кислоты с пропионилом-КоА с образованием а-оксиглутаровой кислоты. Последняя в результате внутримолекулярной перегруппировки превращается в метиляблочную кислоту по следующей схеме:

a-Оксиглутаровая кислота легко распадается на а-метиляблоч-ную кислоту, а последняя — на пировиноградную и уксусную кислоты:

а-Метиляблочная кислота образуется также при декарбокси-лировании лимонной кислоты винными дрожжами по схеме

Исследования показали, что а-метиляблочная кислота не содержится в винограде. Она образуется при алкогольном брожении из сахара в количестве от 70 до 180 мг/л. Концентрация ее прямо пропорциональна содержанию спирта и зависит от условий брожения, в частности от метаболитической активности дрожжей.

Количество а-метиляблочной кислоты зависит также и от рН среды: при рН 3,9 ее накапливается до 80, а при рН 3,2 до 282 мг/л. Количество а-метиляблочной кислоты в белых винах

колеблется от 65 до 147 мг/л и в красных — от 91 до 187 мг/л. Содержание ее значительно увеличивается при выдержке вина.

В вине найдены 2,3-диоксивалериановая, диметилглицерино-вая, или 2-метил-2,3-Диоксимасляная кислоты. Последняя образуется в результате конденсации пировиноградной кислоты с уксусным альдегидом:

Образованная ацетомолочная кислота восстанавливается з присутствии НАД•Н2 в 2-метил-2,3-диоксимасляную кислоту.

Установлено, что содержание а-метиляблочной, диметилглице-риновой и 2-метил-2,3-диоксимасляной кислот зависит от расы дрожжей и их метаболитической активности. Накопление двух последних кислот в винах зависит также от условий проведения брожения. Так при анаэробиозе количество их уменьшается.

В винах были найдены гликолевая, глиоксалевая, фумаровая, пировиноградная, щавелевоуксусная, глюконовая, галактуроно-вая кислоты. Что касается глюкуроновой кислоты, то, по мнению одних авторов, в обычных винах ее нет. Она встречается в винах, приготовленных из винограда, пораженного грибом Ботритис ци-нерея, при этом количество ее достигает 1 г/л и больше. Она образуется в результате окисления глюкозы ферментами этого гриба. По мнению других, глюкуроновая кислота встречается в бордоских сухих винах в количестве 100—200 мг/л.

В выдержанных винах содержится диоксифумаровая кислота. В аэробных условиях она быстро распадается на мезоксалевую, глиоксалевую, гликолевую и щавелевую кислоты.

Согласно данным П. Риберо-Гайона, содержание ароматических кислот (n-оксикоричной, n-оксибензойной и салициловой) в красных винах составляет от 50 до 100, а в белых — до 5 мг/л.

По данным этого же автора, в винах встречаются следующие фенольные кислоты: шикимовая, хинная, ферулевая, галловая, кофейная и протокатеховая. Биосинтез фенольных соединений был показан ранее.

В наибольшем количестве в винах встречаются жирные кислоты. Они находятся в свободном состоянии, в виде сложных эфиров, а также в виде солей. Низшие жирные кислоты (от C1 до С9) при обычных условиях являются жидкими. Обычно, начиная с масляной кислоты до С9, они представляют собой маслянистые жидкости и легко растворяются в воде в определенных концентрациях. Высшие жирные кислоты (от С10 и выше) являются твердыми веществами.

Дрожжевая клетка содержит все ферменты, катализирующие синтез и распад жирных кислот. Основными жирными кислотами вина являются уксусная, н-капроновая, н-каприловая, н-каприно-вая и дециловая. В меньшем количестве встречаются муравьиная, пропионовая, изомасляная, а-метилмасляная, 2-метилдиоксимас-ляная, изовалериановая, 2-оксикапроновая и н-пеларгоновая.

Из высокомолекулярных кислот в винах содержатся лаурино-вая, пальмитиновая, стеариновая, олеиновая, линолевая и др.

  • Реклама