загрузка...
Биохимия вина  |  Образование вторичных и побочных продуктов спиртового брожения
Биохимия вина

Механизм образования сивушных спиртов

До первой половины XX в. господствовало мнение, что сивушные спирты образуются только из продуктов гидролиза белков, главным образом из аминокислот согласно механизму, предложенному Ф. Эрлихом.

В настоящее время доказано, что сивушные спирты образуются как из аминокислот, так и из Сахаров.

Рассмотрим вначале образование сивушных спиртов изаминокислот.

Работами Эрлиха было показано, что при добавлении в бродящий сахарный раствор лейцина образуется 80—87% изопентанола и пентанола, а при введении в бродящую среду фенилаланина и тирозина возникают В-фенилэтанол и тиразол.

Согласно теории Эрлиха образование высших спиртов осуществляется двумя путями. Первый путь — это декарбоксилиро-ванные аминокислоты с образованием амина с последующим его дезаминированием и гидратйрованием в соответствующий спирт. Второй путь — это гидролитическое дезаминирование аминокислоты, в результате чего образуется оксикислота и аммиак. Затем оксикислота, декарбоксилируясь и восстанавливаясь, переходит в соответствующий спирт. Оба процесса можно представить в следующем виде:

Из углеродного скелета аминокислоты образуется спирт, содержащий на один атом углерода меньше, чем исходная аминокислота.

О. Нейбауэр и К. Фромхерц изменили первую часть последнего уравнения. Они считают, что первым промежуточным продуктом окислительного дезаминирования является кетокислота, которая, декарбоксилируясь, образует углекислоту и альдегид (последний восстанавливается в спирт):

Так образуются сивушные спирты из продуктов гидролиза белков, в частности из аминокислоты.

Исследования Н. М. Сисакяна, И. Я. Веселова и Л. Женевуа, а также других ученых показали, что путь образования сивушных спиртов из аминокислот не является единственным. Эти исследования указали на то, что теоретические расчеты между ассимиляцией аминокислот дрожжами и образованием сивушных спиртов находились в несоответствии с результатами экспериментальных данных. В конце брожения количество сивушных спиртов всегда больше, чем должно было быть по теоретическим расчетам. Это несоответствие объясняется тем, что сивушные спирты могут образовываться и из Сахаров. Это подтвердилось в работах Е. Пей-но и Г. Гимберто, Ж. Риберо-Гайона и Е. Пейно, Т. Аираппа, И. Кэстора и И. Гимона. Эти исследователи установили, что аминокислоты ассимилируются дрожжами из среды раньше, чем появляются сивушные спирты. Количество аминокислот быстро уменьшается в первые 18—35 ч брожения. Рост и размножение дрожжей продолжается до 45—50 ч, тогда как основное количество сивушных спиртов обнаруживалось лишь после прекращения роста дрожжей И. Кэстор и И. Гимон объясняют это явление образованием кетокислот, согласно теории О. Нейбауера. При этом авторы нашли, что к концу брожения выход сивушных спиртов в 2,5 раза больше теоретического.

Таким образом, теория Эрлиха не может объяснить, почему не получается баланс между количеством ассимилируемых дрожжами аминокислот и содержанием образовавшихся сивушных спиртов.

Согласно данным Ф. Драверта (1963 г.), содержание в винограде лейцина около 56 мг/л, изолейцина 22,3 мг/л, а виноградном соке еще меньше — до 32 мг/л лейцина и 16 мг/л изолейцина.

Следовательно, по механизму Эрлиха в винах в среднем может образовываться около 23—25 мг/л изрпентанола и 10—12 мг/л активного пентанола. Что касается образования изобутанола, то его количество должно быть еще меньше, так как содержание ва-лина не превышает 10—15 мг/л в виноградном соке.

А между тем в виноградных винах количество сивушных спиртов достигает до 300—350 мг/л. Следовательно, по теории Эрлиха можно объяснить образование только одной десятой части сивушных спиртов, получающихся из аминокислот в процессе алкогольного брожения.

Таким образом, нет прямой зависимости между содержанием аминокислот в виноградном соке и количеством образовавшихся сивушных спиртов в вине.

Исследованиями А. Раппа и X. Франка установлено, что концентрация аминокислот лишь до определенных количеств увеличивает содержание сивушных спиртов. Образование пропанола, изобутанола, изопентанола и активного пентанола во время спиртового брожения по-разному зависит от концентрации аминокислот.

В табл. 13 приведены данные, показывающие, как изменяется количество образовавшихся сивушных спиртов с изменением концентрации сахара.

Из данных, приведенных в табл. 13, видно, что из 72,0 мг/л аминокислот образовалось 306,0 мг/л сивушных спиртов. Это свидетельствует о том, что в основном сивушные спирты возникают из сахара. При увеличении количества аминокислот общее содержание сивушных спиртов уменьшается за счет уменьшения пента-нолов, в то время как концентрация изобутанола значительно увеличивается.

загрузка...

Таким образом, с увеличением концентрации аминокислот соотношение между образовавшимися высшими спиртами меняется.

Количество пропанола и изобутанола растет, а содержание пен-танолов падает. Было показано также, что нет прямой зависимости между содержанием аминокислот в сусле и образованием высших спиртов. Наоборот, существует мнение о прямой зависимости между концентрацией сахара и образованием фенилэта-нола в процессе алкогольного брожения. Образование этого спирта из сахара было показано С. Саписом и Ж. Риберо-Гайоном.

Некоторые ученые считают, что сивушные спирты образуются в результате переаминирования аминокислот с кетокислотами. В 1958 г. С. Антониани с сотрудниками показал, что треонин, триптофан, тирозин, цистеин и глютатион увеличивают выход сивушных спиртов, а метионин, цистин, а-аминомасляная кислота задерживают их образование.

И. Я. Веселов (1964 г.) установил, что при добавлении к обедненной азотистыми веществами среде а-аминомасляной кислоты в результате брожения выход сивушных спиртов увеличивается в 5—7 раз, а при внесении сс-аланина — в 2 раза; В-аланин, у-ами-номасляная кислота, серии, тирозин и глицерин не оказывают значительного влияния на образование сивушных спиртов.

Е. Пейно и Г. Гимберто показали, что при брожении таких аминокислот, как цистеин,. глицин, гистидин, пролин, серии, треонин, образуются значительные количества изобутанола и изопен-танола.

Они объясняют это явление реакцией трансаминирования кето-кислот дрожжами.

А. К. Родопуло, И. А. Егорова и Н. Т. Саришвили (1963) обнаружили, что при брожении аминокислот, за исключением лейцина и изолейцина, на синтетической среде образование сивушных спиртов протекает не по схеме Эрлиха. Так, из глицина, ала-нина, треонина аспарагиновой и глютаминовой кислот образуются сивушные спирты с более длинной углеродной цепью, чем у исходной аминокислоты.

Механизм образования изобутилового спирта из глицина следующий: вначале глицин превращается в аланин, а последний — в валин, который образует изобутанол.

Изопентанол образуется из глютаминовой кислоты по следующей схеме: глютаминовая кислота -> аланин -> валин -> лейцин -> изопентанол.

н-Пропанол образуется из треонина через а-аминомасляную кислоту.

Основными продуктами брожения исследуемых аминокислот были изопентанол, изобутанол и н-пропанол. В этих исследованиях показана связь между синтезом сивушных спиртов из низкомолекулярных аминокислот и теорией Эрлиха.

Важное значение при этом придается аланину, через который наращивается углеродная цепочка других аминокислот. Аналогичное явление наблюдал И. Я- Веселов: при введении в сборожен-ную среду пировиноградной кислоты увеличивалось накопление сивушных спиртов. И. Я. Веселов (1961) считал, что участие в биосинтезе сивушных спиртов пировиноградной кислоты и аминокислот свидетельствует о неразрывной связи углеводного и азотистого обмена веществ в дрожжевой клетке, т. е. можно считать, что в присутствии пировиноградной кислоты образование сивушных спиртов протекает в дрожжевой клетке двумя путями. Первый путь — это реакция переамирования аминокислот сусла и дрожжевой клетки с кетокислотами (главным образом с пировиноградной кислотой) и дальнейшее образование высших спиртов по схеме Ф. Эрлиха или О. Нейбауэра. Реакцию переа.минирова-ния можно представить в следующем виде:

И. Я. Веселов считает, что если количество азотистых веществ, необходимых для аминирования или переаминирования, недостаточно, то кетокислоты накапливаются в среде до тех пор, пока дрожжи лереобразовывают их в соответствующие сивушные спирты. Таково мнение и П. Бидана.

Второй путь образования сивушных спиртов из пировиноградной кислоты можно рассматривать, как биосинтез спиртов из углеводов. Известно, что в начале сахар распадается до пировиноградной кислоты, затем, по схеме К. Иошицава и других, эта кислота конденсируется с уксусным альдегидом или с ацетил-КоА, образуя ацетомолочную кислоту, которая превращается в а-кето-изовалериановую кислоту. Последняя, декарбоксилируясь, дает изомасляный альдегид, который в присутствии НАД-Н2 и алко-гольдегидрогеназы восстанавливается в изобутанол.

Образование изопентанола можно рассматривать как конденсацию а-кетоизовалериановой кислоты с ацетил-КоА, при этом получается а-кетоизокапроновая кислота, которая, декарбоксилируясь, превращается в изовалериановый альдегид. Последний в присутствии НАД-Н2 и алькогольдегидрогеназы образует изопен-танол. Процесс проходит по следующей схеме.

Таким образом синтезируются изобутанол и изопентанол из пировиноградной кислоты, вернее, из углеводов. Этот механизм впервые был выдвинут К. Иошицава и М. Ямада (1966). В последнее время он все больше получает экспериментальное подтверждение.

Исследования Т. Аираппа показали, что при добавлении к бродящей среде меченого С14 лейцина образуется только радиоактивный 3-метилбутанол, а в присутствии меченого С14 валина радиоактивными становятся и бутанол, и 3-метилбутанол.

Это свидетельствует о присутствии в бродящей среде валина, лейцина и изолейцина, сивушные спирты образуются по схеме Ф. Эрлиха. Этот автор также показал, что при низкой концентрации аминокислот большая часть В-фенилэтанола, образуется из фе-нилаланина, а при повышенной концентрации аминокислот В-фе-нилэтанол синтезируется из сахара.

Известно, что если дрожжи облучать ультрафиолетом, то они теряют способность синтезировать лейцин, изолейцин и валин. Полученные мутанты дрожжей также теряют способность синтезировать изопентанол, активный пентанол и изобутанол.

При сбраживании глюкозы мутантным штаммом дрожжей с уксусной кислотой, меченой в положении в 1-С14 и 2-С14, она активно включается в н-бутанол. Наоборот, при сбраживании глюкозы исходным немутантным штаммом дрожжей меченая уксусная кислота в основном включается в изопентанол. Добавление норвалина при сбраживании глюкозы мутантным штаммом приводит к образованию как н-бутанола, так и н-пнетанола. В присутствии норлейцина в качестве источника а-кето-н-капроновой -кислоты в среде увеличивалось образование н-пентанола.

Таким образом, можно считать, что н-пропанол образуется в основном из а-кето-н-масляной. кислоты, н-бутанол — из а-кето-н-валериановой кислоты, а н-пентанол — из а-кето-н-капроновой кислоты, т. е. образование высших н-спиртов происходит по следующей схеме:

  • Реклама