загрузка...
Биохимия вина  |  Ферменты
Биохимия вина

О-Дифенолоксидаза

Этот фермент (02=оксидоредуктаза К.Ф. 1.10.3.1) является одним из наиболее активных, встречающихся в ягодах винограда. Фермент обладает способностью катализировать окисление не только катехинов, но и других фенольных соединений, содержащих 1-2- и 1-3-оксигруппу (ОН), пирокатехин и пирогаллол, а также группу NH2 (ароматические аминокислоты и амины).

(О-Дифенолоксидаза представляет собой белок, в простетиче-ской группе которого содержится от 0,2 до 0,3% меди. Исследования показали, что медь, входящая в состав о-дифенолоксидазы, сохраняется в закисном состоянии, как в отсутствии субстрата при доступе кислорода, так в в присутствии субстрата (пирока техина) в атмосфере аргона и С02.

Так, в 1965 г. Д. Картез показал, что медь в о-дифенолокси-дазе находится в восстановленной форме как в ходе ферментативной реакции, так и в состоянии покоя. Однако другие авторы считают, что основное действие о-дифенолоксидазы состоит в обратимом окислении одновалентного атома Си+ в двухвалентный Си2+. Окислительное действие о-дифенолоксидазы заключается в дегидрировании орго-дифенолов с образованием орго-хинонных форм.

Характерной особенностью о-дифенолоксидазы является способность катализировать две реакции — окисление дифенолов и гидроксилирование монофенолов. Следовательно, о-дифенолокси-даза является не единственным ферментом, обладающим смешанными функциями. Таким же свойством обладает риболозодифос-фаткарбоксилаза.

В реакции гидроксилирования ОН-группа вводится в молекулу субстрата в орго-положении. Этот процесс необходим для того, чтобы превратить монофенолы в дифенолы, так как- о-дифенолок-сидаза окисляет дифенолы.

О механизме реакций, осуществляющих о/?го-гидроксилирование монофенолов, существует несколько мнений. Д. Картез счит тает, что превращение монофенолов в орго-дифенолы осуществляется с участием свободных ионов Си2+, не связанных с белком, причем в роли активного гидроксилирующего агента выступает хинон, согласно схеме:

о-Дифенол -> о-Дифенолоксидаза -> о-Хинон; о-Хинон + Монофенол + Н20 -> о-Дифенол.

По мнению Э. Мэзона (1966), о-дифенолоксидазная активность определяется ионами меди, находящимися в окисленной форме Си2+, т. к. проявление крезолазной активности не обусловлено наличием восстановленной формы меди Си+. Это подтверждается тем, что процесс внедрения второй оксигруппы в молекулы монофенолов осуществляется, как правило, действием о-дифенолокси-дазы в присутствии восстановителей (аскорбиновая кислота, НАД-Н2 и НАДФ.Н2).

о-Дифенолоксидаза ингибируется диэтилдитиокарбоматом; это свидетельствует о том, что фермент содержит в простетической группе ион меди. Медь вступает в химическое соединение с диэтилдитиокарбоматом, который блокирует активную группу фермента, в связи с чем сам фермент теряет активность. Однако, ди-этилдитиокарбомат ингибирует также аскорбатоксидазу, поэтому их трудно различить. Исходя из этого, для идентификации о-дифе-нолоксидазы применяют купреин, который является специфическим только для о-дифенолоксидазы. Этот фермент также ингибируется дихлордифлюрометаном.

В виноделии для прекращения окислительных процессов о-ди-фенолоксидазу обычно ингибируют введением сернистого ангидрида или нагреванием.

Впервые о-дифенолоксидаза была выделена из картофеля Ф. Кубовице, а затем из листьев чайного куста М. А. Бокучавой и др., а из винограда С. В. Дурмишидзе и А. К. Родопуло. Недавно М. Кидрон, Е. Харель и А. Мауер выделили о-дифе-нолоксидазу из винограда. Этот энзим был очищен 334 раза с выходом 30%. Его молекулярная масса 80 000D определена методом седиментации. Содержание меди не превышает одного атома на одну молекулу фермента. о-Дифенолоксидаза в большом количестве содержит аспарагиновую кислоту, затем глютаминовую, пролин и аланин.

о-Дифенолоксидаза найдена в хлоропластах и митохондриях листьев винограда. Удельная активность ее в хлоропластах в 4 раза больше, чем в митохондриях.

Механизм инактивации о-дифенолоксидазы все еще не выяснен. Одни авторы считают, что в результате действия фермента на полифенолы образуются хиноны, которые являются токсичными веществами, потому что дубят белки, и фермент, являясь белком, инактивируется. Другие считают, что о-дифенолоксидаза быстро окисляет пирокатехин и инактивируется продуктами его окисления. Некоторые утверждают, что механизм инактивации заключается в том, что хиноны взаимодействуют со свободными аминогруппами фермента и он при этом инактивируется.

Исследования X. Робертса и Ф. Вуда, проведенные в 1955 г.,. показали, что при действии о-дифенолоксидазы на пирокатехин количество поглощенного кислорода составляло до двух атомов на одну молекулу.

На основании этого можно было считать, что реакция окисления пирокатехина протекает следующим образом:

С6Н4 (ОН)2 + 02 -> С6Н402 + Н202.

Между тем известно, что перекись водорода не образуется. Исходя из этого можно утверждать, что реакция протекает по схеме

загрузка...

Как видно, эта ферментативная система является одной из главных окислительных систем, катализирующих конечный этап оксибиотического процесса.

За последнее время многие ученые отрицают роль о-дифенолоксидазы как терминальной дыхательной системы. Одним из аргументов того, что этот фермент не участвует в нормальном процессе дыхания, является отсутствие его сопряжения с системой запасания энергии. Так, при окислении НАД-Н2 в о-дифенолокси-дазной системе макроэргические связи не образуются и клетки теряют эту энергию. Исходя из этого считают, что в дыхании растений завершающим ферментом является цитохромоксидаза.

Наиболее подробно активность о-дифенолоксидазы изучали Н. М. Сисакян, И. А. Егоров и Б. Л. Африкян (1948), С.В. Дурми-шидзе, А. К. Родопуло. Эти авторы нашли в армянских и грузинских сортах винограда о-дифенолоксидазу, активность которой в процессе вегетации виноградной лозы и созревания ягод винограда увеличивается.

В настоящее время известно, что большинство ферментов существуют в одном и том же организме в виде молекулярных форм, т. е. в виде изоэнзимов. Этому явлению придают большое биологическое значение. о-Дифенолоксидаза является полиморф-лым ферментом с двойной функцией. Она катализирует ортогид-роксилирование монофенолов и окисление орто-дифенолов.

С. В. Дурмишидзе, О. Т. Хачидзе, Г. И. Пруидзе методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле исследовали изо-ферментный состав о-дифенолоксидазы в разных органах виноградной лозы. Интересным является изменение состава изофер-.ментов о-дифенолоксидазы по фазам развития гроздей. Так, например, при завязывании ягод сорта Ркацители было обнаружено 3, а в гребнях 6 изоферментов. В фазе роста в семенах и кожице изоферментный состав меняется. В кожице винограда появились новые изоферменты.

Для изучения субстратной специфичности о-дифенолоксидазы были выделены фракции и испытаны на окисление фенолов. Вторая фракция окисляет хлорогеновую и кофейную кислоты, (+) катехин и пирокатехин с большей скоростью, чем остальные фракции. Выделенные фракции изоферментов о-дифенолоксидазы не катализируют окисление n-фенилендиамина, l-тиразина, n-крезо-ла, т. е. С. В. Дурмишидзе и его сотрудники показали, что о-ди-фенолоксидаза встречается во всех органах виноградной лозы в виде разных изоферментов.

В. Вольф исследовал изоэнзимы о-дифенолоксидазы в зеленых и спелых ягодах винограда сорта Каберне Совиньон. Им было найдено шесть изоферментов, обладающих разной ферментативной активностью.

Также показано, что с момента появления ягод до полного их созревания активность о-дифенолоксидазы и количество фенольных соединений быстро уменьшается в течение одного месяца, т. е. с того момента, как масса ягод и сахаристость увеличиваются.

  • Реклама