загрузка...
Биохимия вина  |  Лимонная кислота
Биохимия вина

Ферменты

Энзимология — наука о ферментах, так называемых биологических катализаторах белковой природы, которые образуются в любой живой клетке и обладают специфической способностью активировать различные химические реакции.

Энзимы имеют большое практическое значение во многих отраслях промышленности и особенно в пищевых: винодельческой, спиртовой, пивоваренной, производстве органических кислот, витаминов и др. Свойства энзимов и механизм их действия привлекают к себе внимание химиков и технологов для разработки новых технологических процессов при производстве различных пищевых продуктов. Для осуществления этих процессов необходимо широко применять ферментные препараты.

В последнее время в США, ФРГ, СССР и других странах созданы фирмы, выпускающие около 200 видов высококачественных ферментных препаратов и кристаллических чистых ферментов.

Коферменты

Получение высокоочищенных ферментов дало возможность установить, что многие из них являются двухкомпонентными и состоят из белка и простетической группы, представляющей собой производное ряда витаминов — это так называемые коэнзимы.

История коферментов начинается в начале XX в. Так, например, А. Гарден и В. Юнг в 1905 г. обнаружили термостабильный небелковый фактор, необходимый для брожения, получивший название козимазы.

Спустя 30 лет в лаборатории О. Варбурга была расшифрована химическая природа коэнзима зимазы. Оказалось, что она состоит из двух коэнзимов: НАД (никотинамидадениндинуклеотид) и НАДФ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат). Действующим началом в них является никотинамидное кольцо, участвующее в окислительно-восстановительных реакциях.

Большое число дегидрогеназ, катализирующих важные процессы метаболизма в живой клетке, содержат НАД и НАДФ. Эти два кофермента участвуют в активном центре дегидрогеназ.

Анализ структуры коферментов и данные относительно их взаимодействия со специфическими белками позволяют выделить две функциональные группы: первая — ответственная за связыва ние с белком, т. е. с ферментом, вторая — обладает каталитической активностью.

Специфичность и механизм действия ферментов

Специфичность ферментов в отличие от неорганических катализаторов огромна. Энзимы катализируют строго специфические реакции. Если энзим катализирует превращение одного субстрата то говорят, что он обладает абсолютной специфичностью. Если фермент действует на ряд веществ, имеющих одинаковые атомные группировки в молекуле субстрата, то такое действие называют групповой специфичностью.

Например, пируватдекарбоксилаза, катализирующая декарбок-силирование пировиноградной кислоты в уксусный альдегид и углекислоту, способна декарбоксилировать кетокислоты с более длинной углеродной цепочкой (а-кетомасляную, а-кетовалериановую и др.), но с меньшей скоростью. Пируватдекарбоксилаза действует на одну и ту же группу субстратов, поэтому ее относят к ферментам с групповой специфичностью.

Если фермент катализирует определенные типы реакций, то считают, что он обладает специфичностью по отношению к определенным типам реакций. Примером могут служить эстеразы, которые катализируют распад сложных эфиров с образованием жирной кислоты с более короткой углеродной цепочкой, в то время как другие липазы быстрее катализируют распад сложных эфиров, содержащих остатки жирных кислот с более длинной углеродной цепью.

Если фермент катализирует превращение только одной стерео- -химической формы субстрата, т. е. если он действует на определенный оптический изомер одного и того же вещества, то это называют стереохимической специфичностью. Примером может служить дегидрогеназа молочной кислоты, которая дегидрирует лишь молочную кислоту и не действует на ее d-форму.

В последнее время исследование структурных и функциональных основ энзиматического катализа, т. е. химической динамики активных центров, является одной из новых и наиболее интересных областей современной молекулярной биологии. Недавно стало известно, что каталитические свойства ферментов обусловлены молекулярно-физическими и химическими закономерностями, которые проявляются в особых условиях: в очень сложных структурах макромолекул глобулярных белков.

Для полного изучения молекулярного механизма действия того или иного фермента необходимо установить химическую топографию активного центра самого фермента и образуемых им промежуточных комплексов. Наиболее точную информацию о структуре активных центров ферментов дает рентгеноструктурное исследование кристаллов ферментов и комплексов, образуемых ими с суб-стратоподобными ингибиторами.

Ло вопросу механизма действия ферментов известно, что вначале образуется комплекс фермент—субстрат. Хотя это соединение лабильное и быстро распадается, все же благодаря применению специальной методики, при которой спектры поглощения автоматически записываются, удалось за очень короткий промежуток времени проследить за его образованием.

Японские биохимики К. Яги и Т. Озава получили кристаллический препарат комплекса фермента-субстрата для оксидазы а-аминокислоты.

загрузка...

Для того чтобы установить как осуществляется каталитическое действие ферментов, необходимо изучить различные функциональные группы и сопоставить полученные данные с результатами исследования первичной, вторичной и третичной структуры фермент-лых белков. Это даст возможность иметь представление об активном центре фермента.

Главной составной частью активного центра фермента является так называемый каталитически активный участок, который вступает в непосредственное взаимодействие с субстратом и образует соединение фермент—субстрат.

Таким образом, действие фермента заключается в образовании в активном центре комплекса фермент—субстрат и последующем распределении электронов в этом комплексе, приводящем к ферментативной реакции.

Для примера рассмотрим механизм действия пируватдекар-боксилазы, которая содержится в дрожжах и играет важную роль в образовании углекислоты в процессе алкогольного брожения. В декарбоксилировании пировиноградной кислоты принимает участие тиаминпирофосфат, который состоит из пиримидинового комплекса, тиазолового комплекса и остатка пирофосфорной кислоты. Тиаминпирофосфат участвует в декарбоксилировании пировиноградной кислоты под действием пируватдекарбоксилазы. Пирови-ноградная кислота взаимодействует с тиазоловым компонентом тиаминпирофосфата и образуется комплекс фермент—субстрат. В дальнейшем происходит распределение электронов в этом комплексе, и он становится лабильным и легко распадается с образованием углекислоты. После этого образуется новый комплекс юксиэтилтиаминпирофосфат, который распадается на уксусный альдегид и на тиаминпирофосфат.

Для отделения молекулы уксусного альдегида от кофермента пируватдекарбоксилазы необходимо разорвать довольно стабильную ковалентную связь С—С. Главным в этом механизме является освобождение протона а-оксигруппы, что способствует отщеплению альдегидного фрагмента. Скорость всей ферментативной реакции зависит непосредственно от кислотности сс-оксигруппы или от способности последней отдавать свой протон.

Оксиэтилтиаминпирофосфат является активным ацетальдеги-цом, который взаимодействует с липоевой кислотой в процессе окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты и других кетокислот. Активный ацетальдегид участвует в конденсации пировиноградной кислоты с образованием ацетомолочной кислоты. Последняя, путем внутримолекулярной перегруппировки, превращается в высшие спирты и аминокислоты.

Некоторые энзимологи сравнивают специфичность ферментов и субстратов с ключом и замком. Так, например, Э. Фишер считает, что фермент подходит к своему субстрату совершенно так же, как ключ к замку. Он полагал, что фермент имеет строго определенную структуру: если субстрат не подойдет к этой структуре, то в этом случае фермент не действует.

Не так давно было высказано предположение, что конформа-ция молекулы фермента и его активного центра могут изменяться под влиянием коэнзима и субстрата, так как присоединение их к ферменту может вызвать изменение конформации молекулы фермента, а следовательно, его физико-химических свойств.

С другой стороны, считают, что действие ферментов обусловлено снижением энергии активации, необходимой для протекания данной энзиматической реакции. Например, разложение перекиси. водорода на кислород и воду (2H202->2H20+02) осуществляется: без фермента с затратой 18 тыс. малых калорий на 1 г-мол, а в присутствии фермента каталазы-—всего лишь до 1500 малых калорий. Из этого примера ясно, что фермент снижает энергию активации.

Известно, что, для того чтобы молекулы действующих масс вступили в реакцию, они должны быть активированы. Одним из способов их активирования является повышение температуры. При этом число молекул увеличивается, они находятся в активном состоянии и скорость реакции при этом повышается. Скорость реакции можно поднять до оптимальной величины. При высокой температуре (выше 50°С) происходит снижение скорости ферментативной реакции в результате разрушения белка, т. е. происходит его денатурация. Исходя из этого, важным показателем, характеризующим отношение белка к температуре, является его термостабильность.

Известно, что для действия фермента необходима какая-то определенная химическая группировка, которая бы характеризовала его активность. Для действия фермента также может быть необходима не одна активная химическая группировка, а несколько специфических групп, расположенных строго определенным образом в молекуле фермента.

Для того чтобы узнать, какие специфические, и функциональные группы фермента участвуют в проявлении каталитического действия фермента, необходимо применить ингибиторы. Для ин-гибирования окислительно-восстановительных ферментов, которые содержат в своей молекуле железо и медь, применяют синильную кислоту. Она ингибирует окислительные ферменты — каталазу, пероксидазу и цитохромоксидазу, — которые содержат в простетической группе железо. Специфическим ингибитором является диэтилдитиокарбамат. Ингибирующее действие оказывает на фермент о-дифенолоксидаза, содержащая в своей молекуле медь.

Другим способом изучения активных функциональных групп ферментов является химическая модификация: окисление функциональной группы, замещение карбоксильной группы на эфирную и др. Применяют также блокировку активных функциональных групп специфическим реактивом. Так, например, для блокирования SH-группы ферментов применяется n-хлормеркурибен-зоат. Например, лактатдегидрогеназу, которая содержит SH-rpyn-пу, постепенно можно ингибировать, применяя различные дозы n-хлормеркурибензоата. Алкогольдегидрогеназа ингибируется п-хлормеркурибензосульфонатом, так как содержит около 28 свободных SH-групп.

Таким образом, главным фактором эффективности и специфичности ферментативного катализа является сложная структура белковой молекулы фермента со свойственным ей многообразием активных функциональных групп.

Известно, что клетка имеет сложную структуру и содержит разнообразные органеллы: ядра, митохондрии, пластиды, рибосомы, лизосомы и др. При исследованиях, проведенных с помощью электронного микроскопа, выяснено, что эти органеллы имеют весьма сложную структуру. В живой клетке ферменты действуют в сложной гетерогенной среде и значительная часть их связана с мембранами. Еще в 1947 г. А. И. Опарин впервые высказал предположение, что действие ферментов зависит от структурной организации протоплазмы. Согласно этой теории, ферменты в живой клетке частично находятся в свободном (растворенном) состоянии, частично адсорбированы на поверхности протоплазменных структур. От состояния данного фермента в клетке зависит направленность ферментативных процессов в организме.

В винограде и вине содержатся оксидоредуктазы и гидролазы. К оксидоредуктазам относятся анаэробные и аэробные дегид-рогеназы.

  • Реклама